|
|
Molecular mechanisms of Wip1 phosphatase function in DNA damage response
Štorchová, Radka ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Fajkus, Jiří (oponent) ; Líčeníková Hořejší, Zuzana (oponent)
Lidské buňky jsou neustále vystaveny různým faktorům, které způsobují poškození DNA a aktivují odpověď na poškození DNA (DDR). V závislosti na závažnosti poškození DNA může DDR napomáhat dočasnému zastavení cyklu buněk (kontrolní bod buněčného cyklu, "checkpoint"), trvalému zastavení růstu (senescence) nebo programované buněčné smrti (apoptóze). Signál DDR je regulován kaskádou post-translačních modifikací, kde klíčovými mediátory jsou fosfoproteinové kinázy ATM, ATR a DNA-PK. Fosfatáza Wip1 (kódovaná genem PPM1D) hraje důležitou roli v ukončení DDR fosforylací mnoha cílů těchto kináz. V této práci jsme zkoumali funkce PPM1D nezávislé na kontrolních bodech buněčného cyklu v buňkách a popsali jsme několik nových substrátů. Zjistili jsme, že PPM1D interaguje se shelterinovým komplexem a nachází se na telomerách. PPM1D desfosforyluje shelterinový protein TRF2 na S410. Fosforylace TRF2 na S410 zvyšovala jeho interakci s TIN2, což nepřímo zvyšovalo množství TPP1 na telomerách. Buňky s overexpresí PPM1D měly zvýšený počet telomerických fúzí. Tato zjištění mohou být velmi důležitá pro některé typy rakoviny, zvláště ty, které vykazují vysoké hladiny PPM1D nebo obsahují mutace v C-konci PPM1D. Pro ověření publikovaných, a detekci možných nových, substrátů PPM1D jsme vyvinuli novou metodu, využívající...
|
|
|
Vliv resveratrolu a kyseliny gambogové na poškození DNA neonatálních potkaních kardiomyocytů vyvolané daunorubicinem.
Mašín, Martin ; Jirkovská, Anna (vedoucí práce) ; Pávek, Petr (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Martin Mašín Školitel: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Název diplomové práce: Vliv resveratrolu a kyseliny gambogové na poškození DNA neonatálních potkaních kardiomyocytů vyvolané daunorubicinem. DNA topoizomerasy jsou skupinou enzymů, které jsou schopny měnit topologii DNA pomocí přechodných jednořetězcových nebo dvouřetězcových zlomů (DSB) během fundamentálních procesů jako je replikace a transkripce. Inhibice topoizomerasy II (TOP II) je hlavním mechanismem účinku některých protinádorových léčiv, včetně antracyklinových antibiotik (ANT; např. daunorubicin). Jejich působením dochází k tvorbě DSB a později k apoptóze. Některé další inhibitory TOP II, které působí jiným mechanismem, mohou ovlivňovat vznik DSB nebo jiného poškození DNA, a tak modulovat také účinek ANT. V této diplomové práci jsme studovali poškození DNA v neonatálních potkaních kardiomyocytech vyvolané daunorubicinem (DAU) a jeho hlavním metabolitem daunorubicinolem (DAUnol) a vliv dvou přírodních látek a inhibitorů TOP II, resveratrolu (RES) a kyseliny gambogové (GA), na poškození DNA vyvolané DAU dvěma odlišnými metodami. Stanovovali jsme míru fosforylace histonu H2AX (γ-H2AX) pomocí imunoblotu a porovnali s výsledky získanými pomocí...
|
|
|
Vliv resveratrolu a kyseliny gambogové na poškození DNA neonatálních potkaních kardiomyocytů vyvolané daunorubicinem.
Mašín, Martin ; Jirkovská, Anna (vedoucí práce) ; Pávek, Petr (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Martin Mašín Školitel: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Název diplomové práce: Vliv resveratrolu a kyseliny gambogové na poškození DNA neonatálních potkaních kardiomyocytů vyvolané daunorubicinem. DNA topoizomerasy jsou skupinou enzymů, které jsou schopny měnit topologii DNA pomocí přechodných jednořetězcových nebo dvouřetězcových zlomů (DSB) během fundamentálních procesů jako je replikace a transkripce. Inhibice topoizomerasy II (TOP II) je hlavním mechanismem účinku některých protinádorových léčiv, včetně antracyklinových antibiotik (ANT; např. daunorubicin). Jejich působením dochází k tvorbě DSB a později k apoptóze. Některé další inhibitory TOP II, které působí jiným mechanismem, mohou ovlivňovat vznik DSB nebo jiného poškození DNA, a tak modulovat také účinek ANT. V této diplomové práci jsme studovali poškození DNA v neonatálních potkaních kardiomyocytech vyvolané daunorubicinem (DAU) a jeho hlavním metabolitem daunorubicinolem (DAUnol) a vliv dvou přírodních látek a inhibitorů TOP II, resveratrolu (RES) a kyseliny gambogové (GA), na poškození DNA vyvolané DAU dvěma odlišnými metodami. Stanovovali jsme míru fosforylace histonu H2AX (γ-H2AX) pomocí imunoblotu a porovnali s výsledky získanými pomocí...
|
|
|
Cell response to genotoxic stress-based anti-cancer therapies
Imrichová, Terezie ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Rossmeislová, Lenka (oponent) ; Rotrekl, Vladimír (oponent)
Tato práce se zabývá buněčnou odpovědí na genotoxický stres; konkrétně odpovědí na protinádorovou léčbu s genotoxickým mechanismem účinku. Buněčná odpověď může mít některý z následujících průběhů: v případě závažného poškození DNA buňky většinou podstoupí apoptózu nebo vstoupí do senescence. Pokud je poškození méně závažné nebo pokud buňkám nefungují kontrolní mechanismy, mohou tyto pokračovat v buněčném cyklu, ať už s úspěšně opravenou nebo s mutovanou DNA. Díky selekčnímu tlaku se v buňkách hromadí ty mutace, které jim poskytují určitou růstovou výhodu v podmínkách trvajícího genotoxického stresu a buňky se postupně stávají rezistentními. Ve své dizertační práci jsem se zaměřila na několik aspektů celého výše popsaného procesu. V prvním projektu, kterého jsem se zúčastnila, bylo mým úkolem charakterizovat populaci radiorezistentních a anoikis-rezistentních buněk karcinomu prostaty. Tato populace byla získána po ozáření buněk 35 dávkami 2 Gy, což je režim běžně používaný v klinické praxi. Po takovémto ozařovacím procesu se objevila populace buněk s nízkou adhezí, která vykazovala zvýšenou expresi mezenchymálních a kmenových markerů. Nízká adhezivita těchto buněk byla vyvolána signální dráhou proteinu Snail a jejich resistence vůči anoikis byla umožněna díky signalizaci ERK1/2. Zjistili jsme, že po...
|
|
|
Molecular mechanisms of checkpoint signalling and termination
Benada, Jan ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
Pro udržení integrity genomu využívají buňky extensivní signální síť nazývanou buněčná odpověď na poškození DNA (DNA damage response). DDR je schopná aktivovat kontrolní body buněčného cyklu (checkpoints), které brání dalšímu průchodu buněčným cyklem a umožňují buňce opravit poškozenou DNA. Poruchy těchto ochranných mechanismů se projevují závažnými lidskými onemocněními, především rozvojem rakoviny. Cílem teto práce je přispět k porozumění toho jak buňky negativně regulují DDR a signalizaci kontrolních bodu buněčného cyklu. Zaměřili jsme se zejména na fosfatázu Wip1 (PPM1D), která je hlavním negativním regulátorem DDR a je nezbytná pro zotavení z kontrolních bodu. Nejprve jsme ukázali, že Wip1 je degradovaná během mitózy APC- Cdc20-dependetním mechanismem. Wip1 je dále v průběhu mitózy fosforylována na několika aminokyselinách, což vede k inhibici její enzymatické aktivity. Navrhujeme, že inhibice Wip1 umožňuje buňkám adekvátně reagovat i na nízkou hladinu poškození DNA, ke kterému dochází i při nenarušené mitóze. V následující publikaci jsme se zabývali tím, proč mitotické buňky spouštějí pouze časnou DDR a nepokračují k akumulaci opravných faktoru jako je 53BP1. Ukázali jsme, že 53BP1 je fosforylován kinázami CDK1 a Plk1 uvnitř motivu, který je zodpovědný za jeho vazbu na ubiquitin. Tyto...
|
|
|
Posttranslační modifikace proteinů účastnících se odpovědi na poškození DNA
Kroupa, Michal ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Novotný, Marian (oponent)
- 4 - Abstrakt V každé buňce vznikají denně tisíce poškození DNA, z nichž nejtoxičtější jsou dvouvláknové zlomy (double-strand breaks, DSBs). Signalizace jejich výskytu a následná oprava takto narušeného chromatinu je zprostředkována mechanismem odpovědi na poškození DNA (DNA damage response, DDR), který zahrnuje akumulaci mnoha efektorových proteinů do oblasti DSBs. Akumulace těchto molekul jsou označovány jako ložiska indukovaná poškozením DNA. DSBs jsou v závislosti na přítomnosti sesterské chromatidy opravovány dvěma hlavními mechanismy: homologní a nehomologní rekombinací. Obě tyto dráhy vedou k aktivaci Checkpoint kináz (Chk1 nebo Chk2), které zahajují přestávky v buněčném cyklu a umožňují tak opravu poškozené DNA. Signalizace poškození DNA a aktivace těchto drah jsou regulovány posttranslačními modifikacemi proteinů, což jsou enzymatické reakce zahrnující především fosforylaci, ubiquitinaci a nově objevenou sumoylaci. Nedávno bylo prokázáno, že ubiquitinace poškozeného chromatinu je nutnou podmínkou pro sumoylaci nádorových supresorů 53BP1 a BRCA1. Poruchy těchto modifikací nebo mutace genů pro 53BP1 a BRCA1 vedou k toleranci poškození DNA a následnému narušení genomové integrity, s čímž souvisí vysoké riziko pro selekci buněčných klonů s nádorovým potenciálem. Současné výzkumy se zaměřují na...
|
|
|
Účast eukaryotických DNA opravných mechanismů ve virové replikaci
Hron, Tomáš ; Španielová, Hana (vedoucí práce) ; Harant, Karel (oponent)
Odpověď na poškození DNA eukaryot je důležitý mechanismus, který zajišťuje stabilitu genomu. Jeho složky jsou mimo jiné mobilizovány i v průběhu virové infekce jako reakce na cizorodou nukleovou kyselinu. Ukazuje se, že některé viry také aktivují DNA opravné mechanismy záměrně a využívají je pro zajištění svého replikačního cyklu. Tato aktivace je z velké části zprostředkována virovými proteiny, které přímo interagují s buněčnými faktory. Klíčové proteiny DNA opravných mechanismů jsou často asociovány s centry virové replikace a pravděpodobně se podílejí na jejím průběhu. Dále jsou také využívány pro navození vhodného prostředí k virové reprodukci v buňce. Konkrétní mechanismy, kterými se faktory DNA opravných drah podílejí na virové infekci, jsou však z velké části nejasné. V této práci jsou shrnuty principy interakce virů s eukaryotickou odpovědí na poškození DNA a popsány hlavní virové čeledě, které ji aktivují a využívají pro replikaci svého genomu.
|
|
|
Mechanisms of phenotypic plasticity induced by genotoxic stress
Přibyl, Miroslav ; Hodný, Zdeněk (vedoucí práce) ; Remešová, Hana (oponent) ; Vomastek, Tomáš (oponent)
Rezistence nádorových buněk vůči léčbě představuje hlavní důvod neúspěšné nádorové terapie. Růst nádorových buněk v primárním místě nádoru nebo jejich šíření a růst v sekundárních oblastech jsou hlavní důvody, proč pacienti nemoci podlehnou. I moderní terapie založené na aktivaci imunitního systému nachází své hranice u mnohých typů nádorů. Rezistence vůči léčbě je zprostředkována nejen nádorovými buňkami, ale i jinými komponenty nádorového mikroprostředí. Porozumění mechanizmům nádorové rezistence zprostředkované nádorovými buňkami, ale i nádorovému mikroprostředí umožní vývoj nových terapeutických přístupů. V této práci představujeme naše nedávné výsledky. Ozařování, 5-azacytidin i IFNγ indukují expresi genu suprabasin (SBSN) a vznik fenotypu nádorových buněk, který je zodpovědný za resistenci vůči terapii a projevuje se nízkou adhezivitou a kmenovými vlastnostmi nádorových buněk. Snížení exprese genu SBSN vedlo k potlačení tohoto fenotypu. Rovněž jsme identifikovali aberantně zvýšenou expresi genu SBSN v kostní dřeni podskupiny pacientů trpících myelodysplastickými syndromy (MDS). Exprese SBSN byla zprostředkována supresorovými buňkami odvozenými z myeloidní řady (MDSCs) a hladina SBSN negativně korelovala se zastoupením T buněk a koncentrací CCL2 v kostní dřeni pacientů. Z toho vychází možný...
|
|
|
The role of DNA repair pathways in ovarian cancer therapy response
Vallušová, Dominika ; Opattová, Alena (vedoucí práce) ; Rössner, Pavel (oponent)
Karcinom vaječníků je závažné a velmi rozšířené gynekologické nádorové onemocnění. V jeho léčbě se jako léčivo první volby používá karboplatina. Avšak, po počáteční terapeutické odpovědi může docházet k relapsu onemocnění s vyvinutou rezistencí vůči karboplatine. Právě nedostatečná odpověď na léčbu a chemorezistence bývá častým důvodem vysoké mortality v rámci tohoto onemocnění. Dráhy odpovědné za opravu poškozené DNA mají význam v terapeutické odpovědi na karboplatinu a taktéž ve vzniku rezistence. Obnova funkce dráhy homologní rekombinace v nádorech je klíčovým mechanismem získané rezistence vůči platinovým derivátům. Na základě těchto poznatků jsme vypracovali hypotézu, že inhibicí homologní rekombinace by bylo možné zvýšit citlivost na karboplatinu. Z tohoto důvodu je hlavním cílem naší práce definovat roli oprav dvouřetezcových zlomů v odpovědi na chemoterapii u karcinomu vaječníků. Protein MRE11 je součástí komplexu MRN, který se účastní opravy dvouřetezcových zlomů. Pomocí mirinu, farmaceutického inhibitoru MRE11, jsme se snažili zjistit vliv homologní rekombinace na účinek karboplatiny a také její roli v získané resistenci. V praktické části práce jsme pomocí biostatistické analýzy ozřejmili asociaci mezi zvýšenou expresí MRE11 a horším přežíváním pacientů s diagnostikovaným karcinomem...
|
|
|
DNA damage and signalling pathways in cellular senescence
Hubáčková, Soňa
Pro mnohobuněčné organismy včetně savců představuje regenerace tkání důležitý proces pro zachování jejich životaschopnosti. Vzhledem k tomu, že je proliferace buněk klíčová i pro vznik nádorů, musely si organismy vyvinout mechanismy chránící je proti zhoubnému bujení. Buněčná senescence jako permanentní zástava buněčného cyklu představuje jednu z bariér proti vzniku nádorů po poškození DNA. Pochopení tohoto procesu proto může vést k nalezení nových terapeutických cílů a optimalizaci chemoterapie u pacientů s rakovinou. V první části disertační práce jsme se zabývali aktivací signální dráhy JAK/STAT u buněčné senescence vyvolané chemoterapeutiky jak v normálních tak nádorových buňkách. Pro tento účel jsme použili genotoxické látky afidikolin, kamptotecin, 5-brom-2'-deoxyuridin, etoposid nebo tymidin. Zjistili jsme, že všechny tyto chemikálie jsou schopny dlouhodobě aktivovat signální dráhy JAK/STAT ve sledovaných buňkách. Aktivace těchto drah byla doprovázena zvýšením exprese genů stimulovaných interferony (ISGs), jako jsou MX1, IRF1, IRF7 a PML. IRF1 a IRF7 se můžou přímo podílet na indukci genů kódujících interferony a u chemicky indukovaných senescentních buněk jsme skutečně zjistili zvýšenou expresi a sekreci IFNbeta a IFNgama, avšak překvapivě ne genů ze skupiny IFNalfa. Inhibice JAK1 jakožto...
|
host ::
RSS.